一、細(xì)胞免疫熒光
1. 細(xì)胞爬片；
2. 冷丙酮4℃固定15min（或用4%多聚甲醛室溫固定10~20min）；
3. 空氣干燥5min，PBS漂洗3min，3次；
4. 細(xì)胞通透：0.5% Triton X-100（溶于PBS）通透細(xì)胞，室溫15~30min（丙酮固定法不用此步驟）；
5. PBS漂洗2次，每次5min；
6. 3% H2O2去離子水室溫孵育10min，PBS洗；
7. 正常山羊血清封閉，37℃孵育10~20min，甩掉封閉液，勿洗；
8. 加適當(dāng)比例的一抗工作液孵育，4℃過(guò)夜或37℃ 1~2h；
9. PBS漂洗2次，每次5min；
10. 加入熒光二抗工作液，37℃，30-60min；
11. PBS漂洗2次，每次5min；
12. DAPI染色2~5min，PBS漂洗2次，每次5min；
13. 抗淬滅封片劑封片；
14. 熒光顯微鏡觀察，拍片。
二、冰凍切片
1. 冰凍切片室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據(jù)需要選擇其他方式。PBS洗，5min，3次；
2. 3% H2O2去離子水37℃孵育10min，PBS洗，5min，2次；
3. 5～10％正常山羊血清封閉，37℃孵育10-20min，傾去血清，勿洗；
4. 適當(dāng)比例的一抗工作液孵育，4℃過(guò)夜或37℃ 1～2h；
5. 復(fù)溫20min，PBS洗3min，三次；
6. 加入熒光二抗工作液，37℃，30-60min；
7. PBS漂洗2次，每次5min；
8. DAPI染色2~5min，PBS漂洗2次，每次5min；
9. 抗淬滅封片劑封片；
10. 熒光顯微鏡觀察，拍片。
三、石蠟切片
1. 常規(guī)石蠟切片60℃烤片2小時(shí)；
2. 脫蠟。二甲苯脫蠟15min，兩次；
3. 水化。依次用無(wú)水乙醇、95%、90%、80%、70%，各一次2min，之后在蒸餾水中孵育5min；
4. 1×PBS（pH7.4）浸泡5min；
5. 抗原修復(fù)：高壓修復(fù)（EDTA，pH8.0或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液，pH6.0高壓10-15min），PBS洗2-3min；
6. 3% H2O2去離子水37℃孵育10min，PBS洗；
7. 正常山羊血清封閉，37℃孵育10-20min，勿洗；
8. 適當(dāng)比例的一抗工作液孵育，4℃過(guò)夜或37℃ 1h；
9. 復(fù)溫20min，PBS洗3min，三次；
10. 加入熒光二抗工作液，37℃，30-60min；
11. PBS漂洗2次，每次5min；
12. DAPI染色2~5min，PBS漂洗2次，每次5min；
13. 抗淬滅封片劑封片；
14. 熒光顯微鏡觀察，拍片。